水性涂料已經成為殺菌劑制造商的重要市場。但是，隨著法律對可使用的殺菌劑種類和量的控制越來越嚴格，涂料產品防腐變得更加具有挑戰性。這包括對甲醛釋放劑、對異噻唑啉酮，以及對重金屬（例如鉻）在涂料產品中的含量限制越來越苛刻。使用這些產品的公司一直在努力尋找符合新法規的方法，同時還要向其客戶提供優質的無微生物產品。涂料行業對傳統殺菌劑的關注，導致業界始終認為不會有新的活性劑出現，但是生物基添加劑提供了扭轉這一趨勢的解決方案。如果僅使用生物添加劑不足以消除所有微生物污染，則可以協同使用它們，以降低所需傳統殺菌劑的量。通過應用生物技術和分子生物學方法，可以進一步降低使用量。此外，通過利用這些安全有效的生物添加劑的潛力，制造商可以擴展到他們可能尚未考慮的市場。本文介紹了生物技術在涂料防腐中的應用，以實現減少或消除傳統殺菌劑的使用這一目標。

在過去的幾十年中，因為溶劑型涂料的比例不斷減少，以及市場對低VOC涂料需求的增長，水性涂料已成為殺菌劑制造商的一個有利可圖的市場。隨之而來的是，越來越多水基系統中的微生物污染和腐敗急需控制，因為這些水性環境和有機營養源提供了非常適合微生物生長的環境。然而，關于所使用的殺菌劑的健康問題，以及對傳統殺菌劑類型和濃度的限制日益嚴格制，對開發新型和低毒性防腐劑的需求日益增強。

不同的微生物類群對涂料性能會產生不同的負面影響。由于這個原因，常規殺菌劑根據其在液態罐內和干膜產品中的使用而有所不同。控制細菌對于罐內保存更加重要，而真菌和藻類則是干膜的最大威脅。在考慮使用防污系統時，微生物和大型底棲動物都要考慮到。在水性體系中，微生物的生長會水解組分，降低pH值，產生氣體、惡臭，使薄膜內的產品變色并降低粘度，從而影響涂層質量。

被批準可用于罐內保存的傳統殺菌劑通常包括甲醛釋放劑、異噻唑啉酮衍生物以及溴化和其他鹵化化合物。這些通常與諸如氨基甲酸酯、季胺、苯基脲衍生物和重金屬之類結合使用，以保持干膜的保存和防污性能。殺菌活性的機制各不相同，包括由于烷基化劑、交聯劑、親電物質、膜破壞劑以及自由基和活性氧的釋放劑所引起的影響。其中一些對人類有直接的影響（例如烷基化劑和交聯劑），另一些如異噻唑啉酮類對人類的直接毒性較低，但在持續接觸后可能引起過敏。這些及其他健康風險以及潛在的環境影響促使許多國家限制其含量和使用（或需要特殊標簽）。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?表1. 常用傳統殺菌劑的實例

表1列出了一些常見的傳統殺菌劑。許多罐內防腐劑均包含2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MIT）或其異噻唑啉酮衍生物之一，構成了諸如Kathon1.5和Rocima之類的品牌產品，法規對所有這些成份的使用和用量的限制在不斷的嚴格化。從對甲醛釋放劑和皮膚增敏劑的健康擔憂，到繼歐洲標準提高后（例如REACH和2013年的EUBiocides法規BPR法案）美國的反應，以及有人一直呼吁避免在建筑產品中完全使用殺菌劑，這些因素持續續給行業帶來壓力。為解決這些日益嚴峻的監管難題，但同時仍要為水性涂料提供所需的保護，需要新穎的方法出現。

生物基分子的例子包括如溶菌酶和葡萄糖氧化酶之類的酶，活性與天然抗菌肽比如防御素相似但分子量較小的小肽，甚至是含有此類分子的整個細胞。可以在液體和干膜包衣系統中通過保留這些分子的自然生物學功能實現直接抗菌或是與傳統殺菌劑的協同抗菌。

本文描述了使用快速分子技術來選擇生物分子實現安全有效地控制微生物污染，并且這些生物分子還可以與現有殺菌劑協同使用，來降低此類傳統殺菌劑的用量。

分子技術在篩選生物基添加劑作為罐內防腐劑中的應用

我們根據抗菌特性，從肽庫中選擇出了長度為6-7個氨基酸（分子量低于1000g/mol）的小肽AMP-6和AMP-7。該數據庫是使用組合合成方法創建的，可產生超過5300萬種可能的肽，能夠針對特定的抗菌活性進行篩選。

圖1A. 肽組合數據庫和抗菌活性。迭代氨基酸取代和相關的對鐮刀菌的最低抑菌濃度（MIC）。

圖1A顯示了用于生成數據庫的迭代氨基酸替代過程的示例以及針對常見絲狀真菌鐮刀菌的最小抑制劑濃度（MIC）。通過改變肽序列，可以“調節”針對特定目標微生物群的活性，例如對細菌對真菌和霉菌。使用組合化學方法，隨著肽化學結構變得更加明確（在這種情況下為6個氨基酸鏈），殺死同一靶標微生物所需的濃度逐漸降低。在AMP-6（6-氨基酸肽）的情況下，對真菌的活性（由較低的MIC數表示）比所測試的細菌（需要更高的濃度）更高。僅添加一個氨基酸，AMP-7就對細菌和真菌均顯示出令人滿意的活性（圖1B）。

圖1B. 兩種肽AMP-6和AMP-7之間的抗菌活性差異。數字表示針對所測試細菌和真菌的MIC。

◆分子生物學技術將測試時間縮短至數分鐘而不是數周

使用基于分子的微生物生存力分析（例如XTT分析）可以快速評估候選抗微生物劑的作用。17XTT是四唑鎓染料（2,3-雙-（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-2H-四唑鎓-5-羧苯胺）被代謝活躍細胞還原為有色產物（較暗的紅棕色孔），與經過熱殺死或用乙醇處理的細胞相比，這些細胞仍保持較淺的黃色（圖2A）。可以使用分光光度計測量吸收光譜的差異，并快速評估細胞群體的生存能力。應用這些檢測方法，有可能篩選抗微生物對特定污染微生物的選擇性，而不是使用具有廣泛毒性的殺菌劑。

圖2A. 使用XTT活力測定法篩選生物添加劑，XTT通過活細胞生產可量化的甲?衍生物。

圖2B顯示，控制假單胞菌的不同污染菌株所需的生物添加劑的濃度可能會發生巨大變化。對于惡臭假單胞菌，幾種藥物在各種濃度下均有效（如新陳代謝的降低百分比更高），而銅綠假單胞菌則需要更高濃度的測試生物添加劑（藍條）。

圖2B-1. 生物添加劑對銅綠假單胞菌的假單胞菌的抗菌活性。更高的代謝減少百分比等于更高的功效。

圖2B-2. 生物添加劑對惡臭假單胞菌的假單胞菌的抗菌活性。更高的代謝減少百分比等于更高的功效。

與現有傳統殺菌劑的協同活性

根據最初的XTT篩選結果，評估了兩種常見的殺菌劑與這些生物基藥劑的協同活性：異噻唑啉酮（MIT）和甲醛釋放劑1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內酰脲（DMDM）（圖3）。

圖3. 與傳統殺菌劑MIT和DMDM結合使用時，對所選生物添加劑的抗微生物活性的評估。 藍色條表示未添加傳統殺生物劑，橙色條表示添加了15 ppm DMDM，黃色條表示添加了15 ppm MIT和指定濃度的葡萄 糖氧化酶或AMP-7。

用于評估生物添加劑和殺菌劑的是六種常見的細菌變質劑的混合接種測試板，包括幾種假單胞菌和其他革蘭氏陰性菌（如腸桿菌和革蘭氏陽性芽孢桿菌）。在第一欄中，這些試劑在15ppm時才有效（15ppm是標記為皮膚敏化劑的臨界值也是更嚴格的EUH208“可能產生過敏反應”的規定值）。在這次分析中，當濃度為15ppm時，幾乎沒有抑制作用（新陳代謝僅降低了約15％），但是當與特定的生物基添加劑結合使用時，效果會有所提高（從15％到超過70％，這與在熱滅活的細胞中觀察到的相當）。特別是具有葡萄糖氧化酶的協同活性，可以達到15ppm的有效殺滅率。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化和隨后釋放的過氧化氫，會引起細胞損傷。葡萄糖氧化酶被美國食品藥品管理局（FDA）列為各種預期用途的公認安全（GRAS），在食品工業中經常使用。它以商業規模生產，并且可以批量購買。通過在XTT分析中測試各種濃度的葡萄糖氧化酶和MIT證實了這種明顯的協同活性。

圖4A. 葡萄糖氧化酶和MIT組合的生長抑制和協同分 析。顯示了不同濃度的葡萄糖氧化酶和MIT的組合的響應（以生長抑制百分數表示）的熱圖。

測試板上細菌對葡萄糖氧化酶和MIT各種組合的反應顯示如圖4A所示，該圖用顏色表達響應度，紅色是生長抑制率最高，綠色是生長抑制率最低。為了測試這兩種化合物之間是否存在拮抗作用或協同作用，通過零相互作用力（ZIP）方法，將葡萄糖氧化酶和MIT組合的響應用于確定協同作用得分，基于實際響應與預期響應的偏差得到評估分數。

圖4B. 葡萄糖氧化酶和MIT組合的協同作用得分的等高線圖，其中正得分（紅色）表示協同作用，負得分（綠色）表示拮抗作用，零得分（白色）表示累加反 應。

在等高線圖中以可視化方式顯示每個組合（圖4B）的得分，結果表明兩種抗菌素通常以協同方式相互作用。葡萄糖氧化酶的濃度在50~500ppm之間，而MIT的濃度在0.15~1ppm以下時，存在協同作用區域，葡萄糖氧化酶濃度在10~1,000ppm之間以及MIT濃度在7~15ppm以下范圍內時可以看到最大的協同作用。這表明葡萄糖氧化酶和MIT在低濃度和高濃度下都可以相互補充，從而達到降低MIT的水平并且顯示有效的抗菌活性的目的。

使用ASTMD2574評估傳統殺菌劑和葡萄糖氧化酶的協同作用

使用快速分子技術檢測葡萄糖氧化酶的抗菌活性，使用傳統的測試方法ASTMD2574油漆腐敗標準進一步測試作為罐裝涂料防腐劑的防腐性能。通過使用上述分子方法快速篩選目標微生物，選擇經典測試（例如ASTMD2574），挑中最有希望的候選對象。

圖5. 第七天 ASTM D2574 結果的示例照 片。

使用不含殺菌劑的丙烯酸膠乳（請參閱附錄-配制材料和方法），使用和XTT分析使用的防腐敗劑測試板一樣的測試板；在七天內對樣品進行監測。用于ASTMD2574的所選葡萄糖氧化酶劑量基于XTT分析的結果，其中50ppm顯示與MIT和DMDM協同作用，而5ppm僅與DMDM協同作用。圖5顯示了最后一天的生物基添加劑和傳統殺菌劑的測試板。在為期7天的監測期內，無殺菌劑的乳膠樣品每天得分均為4（完全過度生長）。

? ? ? ? ?? ? 表2. ASTM D2547不含殺菌劑的丙烯酸乳膠的挑戰結果

推薦劑量的MIT和DMDM在第1天評分達到了0（無增長），而較低的15ppm劑量DMDM的效果較差，在第7天仍顯示4，MIT在第5天仍未達到0。但是，在使用不含殺菌劑的膠乳的ASTM方法中，最低的葡萄糖氧化酶測試濃度（50ppm）在第1天達到了0，而與15ppm的MIT或DMDM結合使用時，在第1天也達到了0（表2）。

雖然單獨使用葡萄糖氧化酶顯示出如此高的活性是一個積極的結果，但為了表征在丙烯酸乳膠中與傳統殺菌劑的任

檢測和消除油漆變質劑的分子方法

雖然像ASTMD2574這樣的經典測試方法可以確定殺死所有挑戰性生物的廣譜抗毒性試劑，他們無法選擇性地鑒定出對特定菌株有效的藥物。通過使用DNA測序方法，可以特異性地識別哪些細菌被特定的生物基添加劑殺死以進行精確處理（圖6A）。

圖6A. 使用聚合酶鏈反應（PCR）和測序對腐敗微生物進行分子檢測。 測序結果與目測觀察結果的比較。

實時定量聚合酶鏈反應（PCR）用于直接分析涂料中的微生物污染并鑒定特定污染物。圖6B顯示了使用選擇性探針鑒定特定細菌種類的結果。當菌株特異性探針成功擴增靶DNA，熒光明顯增加。這方法也可以用于確定污染水平。

圖6B. 使用實時定量 PCR檢測特定微生物和污染水平。

圖6C顯示了使用腸桿菌的劑量反應曲線，顯示了在不同濃度下擴增所需要的循環次數的變化。通過確定細菌污染的具體水平并進行相應的處理，減少了在產品中使用高劑量的廣譜毒性殺菌劑的需求。

圖6C. 使用腸桿菌的劑量反應曲線。

使用基于生物的添加劑擴大市場：食品安全和對抗抗生素耐藥性

使用一些具有多種應用GRAS認證的低毒性生物基添加劑，制造商可以拓展罐裝涂料防腐劑以外的新市場——例如食品包裝。基于抑制瓊脂平板上微生物菌落形成的快速篩選技術被用于尋找抗大腸桿菌的活性劑以及探索活性劑之間的任何潛在協同作用。

圖7A顯示了涂有聚乙烯醇（PVA）的2.5厘米聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）小切口的圖像，該切口摻入了用于測試瓊脂平板上污染物抑制（在此情況下為大腸桿菌）的生物添加劑。隨著每種藥物濃度的增加，觀察到生長受到抑制，可以通過塑料下可見菌落數量的減少來衡量。通過將兩種試劑結合，可以進一步降低所需的每種試劑的濃度。

圖7A. 用于篩選食品包裝生物添加劑的方 法。接觸帶涂層的圓盤后大腸桿菌的生長（如細菌菌落所 示）。與具有增加的 AMP-7或殼聚糖濃度的涂層圓盤接觸后， 大腸桿菌的生長（如 細菌菌落所示）。涂 膜盤下方的透明區域表示缺乏細菌生長。

根據這些結果，使用食品模擬肉餅（帶有細胞生長顏色指示劑的微生物生長培養基）進行了實驗室規模的測試，可以用測試微生物對其進行挑戰，然后使用生物添加劑涂層的密封塑料本身進行真空密封，或將其夾在具有生物添加劑涂層的插入件之間，以防止食源性污染（圖7C）。如圖7B中所示，在包裝涂層中最佳劑量的生物添加劑時，大腸桿菌的生存力降低至零（無菌落）。

圖7B.瓊脂平板顯示大腸桿菌的生長，并被殼聚糖和 AMP-7組合抑制生長。

市場拓展的其他案例包括推出有助于解決日益增長的全球醫療保健問題：抗生素抗藥性的產品。不僅需要安全有效的抗菌劑（例如上述基于生物的藥劑），而且還需要對抗抗生素耐藥性轉移的方法（當細胞裂解時，DNA溢出并可以被其他細胞吸收）。

圖7C. 食品包裝測試系統示意圖。

目前已經成功創建了酶促涂層表面，在被其他細胞吸收之前可以降解并破壞從細胞中溢出的無細胞DNA。

圖8左上方的測試板顯示出了AMP-7（總固形物的3％）對大腸桿菌的有效殺滅，將其放置在受污染的瓊脂平板上時，與對照相比，AMP-7聚氨酯切口邊緣周圍缺乏細菌菌落的生長指征。圖8中間的測試板顯示了含有核酸酶DNaseI（總固體含量1.5％）的聚氨酯涂層對DNA的破壞。此處使用的DNA帶有對氨芐西林（一種與青霉素有關的β-內酰胺抗生素）具有抗性的基因。暴露后，將DNA從涂層表面重懸并進行分析。在圖8中間圖的兩端的條帶分別是每個涂層控制的三個涌（基材本身或聚氨酯涂層）。中間的條帶是DNA暴露在含核酸酶的涂層中的涌。當暴露于含核酸酶的涂層表面時，盡管可以看到較小分解產物的涂片，不再檢測到明顯的條帶，表明DNA已被破壞。

圖8. 抗菌活性和使用AMP-7 /核酸酶涂層消除大腸桿菌對游離質粒DNA 吸收。

此外，在圖8的右側，證明了在含有DNA的氨芐青霉素抗性基因暴露于核酸酶包被的表面之后，沒有發生抗生素抗性向大腸桿菌的轉移。此圖像中的瓊脂板添加了氨芐青霉素，只有能夠直接從表面提取DNA的大腸桿菌才能生長（n=3：36、37和26個菌落）。但是，由于DNA被破壞，來自核酸酶涂層表面的大腸桿菌對氨芐青霉素沒有產生抗藥性，導致沒有菌落生長（n=3：0、0和0菌落）。圖8的底部總結了整個過程。在細菌被AMP-7裂解并殺死后，游離DNA被被膜中的核酸酶降解，并且抗性基因未通過。

進一步的涂料制造應用以降低殺菌劑水平

在涂料制造領域，這些技術可進一步擴大應用范圍和市場領域，如外科手術式打擊般通過在涂層制造工藝流程中加入選定的生物添加劑，以減少在最終產品中摻入高含量殺菌劑的需求（圖9A）。通過使用前面提到的分子方法，可以快速識別源污染物，并在污染點用生物添加劑對設備線和材料進行相應處理。通過利用酶等生物分子和AMPs的可調性，這些試劑在植物中的靶向使用成為可能。

圖9A. 精確使用生物添加劑來控制微生物涂料的腐敗，在生產過程中確定污染點。

如圖9B所示，通過用生物添加劑保護劑覆蓋罐本身，這種保護可能會從工廠一直持續到消費手中，而無需罐內添加殺菌劑。罐壁和油漆/頂空界面處更容易接觸到氧氣，使微生物得以生長，蓋子上的冷凝物堆積使這里成為另一個潛在的問題部位。

圖9B. 在容器上涂涂料以抑制所添加產品中的微生物生長。

結論

總而言之，鑒于傳統殺菌劑使用所面臨的日益嚴峻的監管挑戰，需要采取其他措